精準識别腫瘤診斷和預後的密切相關的生物标志物，如蛋白質和RNA，對腫瘤及早診斷和治療具有重要作用。MicroRNA（miRNA）被是腫瘤早期診斷和治療的有效生物标志物，如何建立穩定、高效且靈敏度高的miRNA成像方法，保證結果的可靠性和一緻性，是制約 miRNA 成為早期診斷臨床應用的一個關鍵環節。RNA熒光适配體是一段能夠特異性地結合小分子熒光團，并誘導和增強其發光的RNA序列。RNA熒光适配體較熒光蛋白更易于編輯，具有信噪比高、細胞毒性低、特異性強以及光穩定性好等優勢，為胞外和活細胞内功能性物質的可視化研究提供了新的強有力工具。

近期，利记官方网站李長明教授，郭春顯教授，谷雨副教授課題組報道了一種基于熵驅動的鍊取代反應結合熒光RNA适配體技術，成功實現了體内miRNA高靈敏度成像。MiRNA作為靶分子，引發熵驅動的鍊取代反應，從而釋放大量的Corn适配體并點亮DFHO的熒光。該方法不需要結構複雜的tRNA支架，即可高效的自組裝成光穩定性好的熒光結構，成功實現了活細胞和體内内源性miRNA分子的高選擇性成像。相關成果以“In Vivo Imaging MicroRNA with Bright Fluorescent RNA Aptamer through Target-Mediated Entropy-Driven Toehold Exchange”為題發表在國際化學權威雜志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.4c00510）。該論文的通訊作者為利记官方网站利记SBOBET官网APP李長明教授，郭春顯教授，谷雨副教授和2022級研究生白瑞為共同第一作者。

研究的主要内容

具體成像原理如圖一所示，該體系由兩部分組成：一個單鍊（S1）和由兩個DNA單鍊S2、S3和一個Corn适配體反應生成的底物（S）的三鍊結構。其中，S3與Corn适配體和S2部分互補，因此S具有三個不穩定的立足點，以誘導鍊置換反應進行。在沒有目标物的情況下，S1無法與S反應，鍊取代反應無法進行，但當加入目标miRNA後， 底物S中的S2鍊首先與miRNA之間的發生鍊取代反應，形成S3、Corn和T的不穩定三鍊結中間體（I1），并暴露含有4個核苷酸單鍊結構（5'-AACT-3'）的尾鍊。這種亞穩結構的中間體可繼續和S1發生鍊取代反應，釋放RNA适配體Corn和目标RNA。同時，釋放的目标RNA會觸發另一個熵驅動的鍊取代反應，從而釋放更多的Corn适配體。該适配體可形成頭對頭的G-四鍊體二聚體結構，結合并激活DFHO的熒光，在活細胞内（圖二，圖三）和體内（圖四）實現了不同豐度miRNA的精準成像。

圖一：基于熵驅動的鍊取代反應和熒光RNA适配體實現微小RNA的體内成像原理

圖二：(A)細胞内miR-125b成像示意圖。(B)用DFHO轉錄S和S1在PC-3細胞中共聚焦成像細胞内miR-125b。對照細胞僅用DFHO孵育，所有比例尺對應為25 μm。(C)用Leica 3D 成像獲得的PC-3細胞用DFHO轉錄S和S1的3D合并圖像的平面和截面圖。(D)熒光信号的統計直方圖。(E)用EDTE-DFHO(黃色)、DFHO(綠色)和對照細胞(紫色)轉染PC-3細胞的流式細胞術分析。

圖三： 使用EDTE-DFHO對不同細胞中miR-125b表達水平的共聚焦圖像圖及相關熒光統計直方圖。所有比例尺均為25 μm

圖四：(A) Hela細胞成瘤的小鼠體内miRNA-21成像示意圖。(B)瘤周注射探針和DFHO後，不同時間點的小鼠miR-21熒光成像：a. 對照組；b (1.3 cm) 和c (2.0 cm) 為不同腫瘤體積的小鼠。(C)圖6B中腫瘤部位的熒光強度。(D)轉染探針24h後小鼠腫瘤的染色組織學切片。标尺:50µm。

本研究報告了一種通過熵驅動的鍊取代反應對 miRNA 進行高靈敏度和選擇性成像的通用性策略，其中 miRNA 充當催化鍊來啟動熵驅動的鍊取代反應，并不斷反饋循環釋放适配體Corn，從而點亮 DFHO 的熒光，極大的增強了熒光信号的強度。該體系選擇性好，避免了熒光染料的預修飾和熒光蛋白的長時間表達，僅需要簡單的核酸結構，而不是莖環，tRNA折疊等複雜的二級結構，即可實現目标物的熒光信号放大，并成功應用于細胞和體内成像。與報道的基于Corn的“一對一”成像模型相比，該方法對相同miRNA細胞内成像的信噪比顯著提高了4.6倍。此外，通過更改探針的識别單元，可實現包括miRNA-125b和miRNA-21在内的不同miRNA的高靈敏度成像，具有普适性，為研究腫瘤相關 miRNA 的功能和相互作用提供了潛在的工具，在臨床診斷和預後中具有指導作用。